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重组蛋白表达
发布时间:2012年02月10日来源:字体:[大][中][小]

一、目的基因的获取:
    1、从数据库中搜索客户蛋白的基因序列;序列优化,包括偏爱密码子使用、密码子使用频率、GC含量、mRNA二级结构等的优化;优化序列的全基因合成及拼接。
    2、根据客户提供的材料提取mRNA,RT-PCR获得目的基因。
    3、将目的基因克隆在常规载体上,序列分析。
二、目标基因的克隆:
    1、根据客户要求设计引物,扩增目的基因。
    2、将目标基因克隆到客户选择的载体上。
    3、测序验证重组质粒符合客户设计要求。
三、表达质粒的转化及筛选:
    1、扩增并抽提构建好的表达质粒。
    2、表达质粒转化感受态E. coli菌株中。
    3、挑选3~5个重组菌扩增并诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE分析筛选。
四、目的客户的表达及纯化:
    1、根据客户需求量培养表达菌,通过亲和层析、离子交换层析、疏水及凝胶过滤层析等方法纯化表达的重组蛋白。
    2、使用下游工具酶如:SUMO蛋白酶、EK酶、TEV蛋白酶、凝血酶去除标签蛋白,再纯化获得目的蛋白。
    3、含量测定。
    4、通过SDS-PAGE和WB进行产品纯度的分析和特异标签的鉴别。
    5、根据客户要求可进行等电点、分子量、N-端和C端序列分析、RP-HPLC分析、CD光谱扫描分析、ELISA、生物学活性分析。
五、大规模制备:
    根据客户要求放大生产规模,制备客户需要的目的蛋白产品。