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产品名称:BioScript III反转录酶
产品简介:BioScript III重组RTase,大肠杆菌表达经过高度纯化的M-MLV反转录酶
 

        BioScript III 反转录酶(RTase)是一种重组M-MLV反转录酶。本产品采用大肠杆菌表达体系,是经过高度纯化的重组酶。该酶的RNA酶H活性很低,具有更高的热稳定性,广泛应用于第一链cDNA 的合成,反转录温度高达55°C,特异性和cDNA产量明显提高,长度明显大于第一、第二代反转录酶。BioScript III RT产生的cDNA长度可达12 kb。

        BioScript III RTase(200 U/μl)Cat No. RE-12-001   2,000 U          10,000 U

        5X RT 缓冲液(含0.25M DTT)                                  1000 μl             1000 μl

第一链cDNA的合成

1、在灭菌离心管中加入:
    RNA 模板(10 pg~5 μg 总RNA 或者10 pg~500 ng mRNA)
    1 µL oligo(dT)20(50 μM), 或者其他引物        
    1 µL 10 mM dNTP Mix                           
    补加DEPC处理水至终体积13 µL.

2、65°C 家人3-5,离心后置冰浴备用;

3、加入:
       4 μl 5X RT缓冲液

      1 μl RNA酶抑制剂(10 U/µL,可选择)

      1 μl BioScript III RTase (200 units/μl)

      终体积20 µL

       如果产生的cDNA长度大于5 kb,反转录温度高于50°C,应该使用基因特异性引物或者oligo(dT)20,为了提高产量,BioScript IIIRtase的量可提高到400U (2 μl);

4、通常37°C进行反转录反应15min,50°C保温30–60min,特异性明显提高,基因特异性引物温度可提高到55°C,对于复杂的模板或者二级结构含量高的模板,温度也可以提高到55°C;

5、70°C处理15 min使酶失活;

6、将反转录产物置-20°C备用或者取2µl第一链cDNA合成产物继续进行PCR扩增。

        对于有些目的基因(>1 kb)的扩增,可能需要去除与cDNA互补结合的RNA。去除互补RNA的方法:反转录产物加入大肠杆菌RNase H 1 μl (2 units),37°C保温20 min。

7、结果举例

      

        保存于-20°C,缓冲液使用前室温化冻,使用后立即冻存。